为什么提取植物RNA这么难？如何解决？

植物RNA提取中常见的问题是提取产物的总量少，RNA质量差。植物的细胞中有很多代谢物，如蛋白质、脂质、多糖和次生代谢物等。进行RNA提取时，必须裂解细胞破坏植物膜释放RNA，在裂解步骤中RNA不可避免会与这些代谢物混合。这些代谢物在结构上与核酸相似，会发生共沉淀反应，从而降低了RNA提取的产量和质量。抽提足够的高质量植物RNA的难点就在于将RNA与这些代谢物进行分离。

除了代谢物丰富以外，还有一些特性也会增加植物RNA的提取难度：

1、氧化多酚类次级代谢物（如醌）可以与核酸发生不可逆的结合反应，并成为后续反应的抑制剂或降解RNA；

2、许多植物样品存在一些固有特征，比如含有高水平RNases（会降解RNA）、由于高含水量导致RNA浓度很低，纤维组织（如木质素）难以分解和移除等。

目前已经发布了数以千计的植物RNA提取方案。但大多数都基于以下三种方法：

苯酚法：主要用于具有高浓度次生代谢物的植物。苯酚通常与氯仿结合以去除多糖污染物。

Trizol法：Trizol已被用于从特定组织（如拟南芥种子）中提取RNA。Trizol是一种市售试剂，可将苯酚和异硫氰酸胍结合在单一溶液中，以便在快速分离过程中产生高产量的RNA。在这种方法中，trizol与氯仿、异丙醇和乙醇在无RNase的水中混合以去除污染物。

CTAB法：十六烷基三甲基溴化铵或基于CTAB的方法已用于提取具有高多糖、二级产物或高水平RNase的植物样品。CTAB提取缓冲液基本上由2%十六烷基三甲基溴化铵、1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、100mM Tris-HCl、1.4M NaCl和20mM EDTA组成。这种方法首先去除多糖，然后是蛋白质，最后是次级代谢物。该方法还可以添加浓度约为0.5%的十二烷基硫酸钠（SDS）。SDS是一种去污剂，可与蛋白质形成复合物，有助于在提取过程中去除蛋白质污染物。

大多数RNA提取可分为四个步骤：

1、均质化：组织可新鲜或冷冻获取。当没有合适的实验室条件时（如从野外工作中收获），样品会在室温下保存在高盐溶液中，直到在实验室处理。使用新鲜或冷冻组织时，样本准备好后，通常将其放置在研钵中用研杵研磨成细粉（也可以使用带有珠子的均质器）。

2、裂解：组织变成粉末后，加入裂解液。在这种情况下，可以使用苯酚、Trizol或CTAB裂解细胞以释放RNA，这一步骤很容易产生杂质污染。这是因为当细胞膜破裂时，所有细胞内容物会同时释放，这意味着RNA与所有其他细胞成分结合，多糖和多酚等代谢物可以与RNA更紧密地接触。同时，RNA酶也开始发挥作用，增加了RNA降解的风险。有些提取试剂的作用类似于RNA酶抑制剂，可以减少RNA完整度受损的可能。

3、清洗：使用不同的互补试剂去除杂质，例如多糖、蛋白质和次级代谢物等。氯仿和异丙醇等试剂分别用于去除多糖/次级代谢物和蛋白质。此外，可以使用基于过滤柱或基于酶的方法去除污染的基因组DNA。

4、沉淀：纯化和清洗抽提得到的RNA，进一步去除杂质，以便后续使用。70%的乙醇、0.1%（v/v）焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水或无DNase和无RNase的水都可以用来保存提取的RNA。最后，一旦RNA溶解在其中一种试剂中，必须在-80°C条件保存。

在此，我们从众多提取方案中选择了六种非常重要的试剂/操作方法，希望可以重点关注。

裂解液：用于破坏细胞膜并促使RNA释放。通常是Trizol、苯酚或CTAB缓冲液。

氯仿：用于去除多糖。建议使用氯仿进行两次洗涤以获得更好的结果。

异丙醇：去除蛋白质

乙醇：沉淀。通常RNA在70%乙醇中沉淀。

不含RNase和DNase的水：用于RNA提取的所有步骤，也可以用DEPC处理的水代替。DEPC处理水是通过将一定体积的蒸馏灭菌水与DEPC试剂（0.1%v/v）混合来制备的。

RNase：像RNaseA这样的RNA酶是一种嘧啶特异性酶，可在胞嘧啶和尿嘧啶残基处降解单链RNA。

通常，有关RNA的研究旨在分析mRNA，因为它编码蛋白质行使功能，是研究基因表达和调控的关键。但是，提取RNA时，会得到所有不同类型的RNA混合物。

可以通过计算μgRNA/mg组织来对RNA产物进行定量。然而，RNA定量是根据产物中占比最多的核糖体RNA进行评估的，因此，mRNA是间接地通过凝胶上的rRNA估值计算的。

如何通过估值“间接测量RNA”？

植物中的核糖体由两个亚基组成，较大的亚基称为28SrRNA，较小的亚基称为18SrRNA。当这两个亚基都存在于凝胶上时，表明RNA质量很高。如果RNA降解，其中一条条带可能看起来模糊不清，或者两条条带都不会出现。

NanoDrop分光光度计是一种用于验证获得RNA的浓度和纯度（或质量）的仪器。为了评估提取的RNA的浓度和纯度，研究人员会计算230nm、260nm和280nm处的吸光度比率。

如果RNA是纯的，则260/280比率预计约为2。如果该比率明显较低，则表明存在苯酚、蛋白质或其他在280nm或附近强烈吸收的污染物。一般情况，260/230的比率，预计在2-2.2之间。如果该值相当低，则表明存在杂质（如：碳水化合物、EDTA、异硫氰酸胍和苯酚等）。低于预期的比率可能需要额外的清洗。

（1）把所有东西都放在冰上

为了抑制RNase活性，我们要确保RNA提取过程的每一步以及该过程中使用的所有工具都保持低温。

（2）使用过滤移液器吸头

使用非过滤移液器吸头时，移液器筒的内部可能是污染源，而过滤器吸头可阻止颗粒物污染。

（3）戴手套

赤手是RNases的主要来源。在RNA提取时要始终戴手套并经常更换。

（4）始终使用不含RNase/DNase的水。

可以购买不含RNase/DNase的水，也可以使用DEPC制备的溶液，该溶液的作用是使RNase酶失活，避免RNA降解。

（5）其他清洗步骤

有时根据不同的植物种类可能需要额外的清洁，例如，如果您的样品含有大量多糖，则可以用氯仿清洗；若样品含有大量蛋白质污染物，则可以使用丙醇清洗。

（6）基因组污染

植物 RNA 提取的过程中，DNA 也会被释放出来，因此基因组 DNA 的去除是影响 RNA 质量的关键因素之一。

在使用琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 质量时，若存在 DNA 残留，在 RNA 条带上方、点样孔下方会存在一条带（如图 1 所示）。DNA 残留会对后续实验会造成一定的影响。

解决方法：

（1）柱提法：减少样本起始投入量，或使用脱氧核糖核酸酶 Ⅰ 进行膜上消化；

（2）细胞/组织总 RNA 提取法（Trizol 法）：向裂解液中加入氯仿后，需要在低温下高速离心；向裂解液中加入氯仿后分层，吸取上清时避免吸到中间层和下层；

（3）若后续进行 RT-qPCR 实验，逆转录时可选择含有基因组清除模块的产品。

（7）酚类化合物

很多植物组织特别是植物果实和树木类植物中富含酚类物质，它的含量会随植物的生长而增加，且针叶类植物的酚类物质含量要高于落叶类植物。

纯净的酚为无色，但易氧化为红色至褐色的氧化产物。在提取植物 RNA 进行匀浆时，会产生「褐化效应」，酚类物质会释放出来，氧化后匀浆液变为褐色，并且随着氧化程度的增加而加深。被氧化的酚类化合物可与 RNA 稳定的结合，从而影响 RNA 的分离纯化。

解决方法：

（1）选择幼嫩的组织作为实验的材料；

（2）在裂解样品的同时加入合适的抗氧化剂。

（8）多糖物质

多糖是一种高分子聚合物，常见的多糖包括淀粉、纤维素等。植物组织中通常富含多糖，如马铃薯块茎、甘薯等。多糖的许多物理性质和 RNA 相似，因此很难将其与 RNA 分开。同时在沉淀 RNA 时，多糖还会产生胶状沉淀，影响后续的操作。另外，多糖还会抑制后续实验的酶活性。

解决方法：

可通过盐酸胍处理去除部分多糖；在高浓度 Na+ 或 K+ 条件下，可通过苯酚、氯仿除去部分多糖；此外还可以通过 LiCl 沉淀 RNA，将多糖留在上清。但即使通过这些步骤也还会有很大一部分多糖与 RNA 分离不开，还需要更多有效的解决办法。

（9）蛋白质

蛋白质是影响 RNA 质量的另一重要因素。细胞均含有大量的蛋白质，同时 RNase 也属于蛋白质，因而去除 RNA 中的蛋白质在很大程度上会影响 RNA 的提取效果。

解决方法：

（1）冷冻条件下研磨植物材料抑制 RNase 活性；

（2）裂解液中添加合适的蛋白变性剂，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等；

（3）添加适量蛋白酶 K 以消化蛋白质，再进行进一步的纯化。

（10）次生代谢产物

次生代谢产物在植物对生态环境的适应上有着重要作用，其是细胞生命活动或植物生长发育正常进行的非必需小分子化合物，它的产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性。

常见的次生代谢产物包括苯丙素类、醌类、黄酮类、单宁类、类萜、生物碱等，这些次级代谢产物容易与 RNA 结合一起被抽提出，从而影响 RNA 的质量。

解决方法：

次生代谢产物多种多样，且很多成分尚未完全鉴定，因此还没有非常完整的方法来去除这些代谢产物。目前可以使用选择性沉淀法、氯化铯梯度离心法和 RNA 回收纯化法等来分离纯化植物组织 RNA。

除了关注上面干扰植物 RNA 提取的因素，RNA 提取实验作为各种分子生物学研究实验的基础，在实验操作中，大家往往还会关注的是以下两点：

提取时长：提取大量植物样本时，事半功倍肯定是最理想的效果；

样本兼容性：样本涉及到简单植物、多糖多酚植物时，能做到兼容并包是不二选择。

（11）柱纯化试剂盒和Trizol的区别

目前常用的总RNA提取方法主要分为两类，一类是基于核酸柱纯化技术的试剂盒，一类是经典的溶剂提取法，以Trizol®为代表。

柱纯化法的单价较高，但是提取过程相对简单，通常无需额外准备有害的溶剂，无需低温离心机，新手易操作，所得RNA的质量非常高，但是样品间的稳定性稍差，尤其是价格低的试剂盒，比较容易出现吸附柱之间的效率差异甚至出现坏柱子，对非常珍贵的样品来说有一定的风险。

溶剂提取法试剂非常便宜，但是提取过程稍稍复杂一些，对移液的要求较高，需要低温离心机，需要使用有害的氯仿等溶剂（Trizol试剂本身就是十分有害的），优点是样品间的一致性很高，并且一份植物材料可以同步提取基因组DNA和总蛋白，一箭三雕。

柱纯化法和溶剂法最大的区别是对小RNA的提取效率不同。除非特别强调，一般的柱纯化试剂盒对小RNA的提取效率远远低于长片段RNA，因此普通柱纯化试剂盒通常只适合蛋白表达基因的分析（100 nt以上），不适合miRNA、snRNA、4.5S rRNA、5S rRNA等小RNA分析，但是沉淀法可以有效的提取小片段RNA，适用于所有长度RNA的分析。根据实验室的经费和仪器情况，固定选择一种提取方法并坚持使用，两种方法交替使用有可能对qRT-PCR的结果造成一定的波动。

（12） 采样时的注意点

RNA极易受到RNA酶的降解，基因表达对各种环境因素的变化高度敏感。基于以上这两点，采样时必须要快速、低温，样品间尽量保持操作一致，特别是对于需要转录组测序的样品，需要格外注意。

任何微小的环境因素变化，包括光照、温度、机械震动、湿度等，都会导致某些基因的表达快速发生变化，有些基因表达响应甚至快到几分钟、几十秒以内。如果样品较多，确保有足够多的人手能够同时收样，植物材料离体后迅速用大量液氮冻透，保存在-80℃冰箱，如果需要长期保存，最好添加RNA稳定剂/保存剂。

（13）样品研磨和分装

充分的研磨是RNA产量和质量的保证。确保整个研磨过程中植物材料从未过热融化，所有研磨器材、器皿都用液氮时刻充分预冷，特别是分装研磨好的粉末的时候，由于比表面积太大，极易潮解融化，大大增加了RNA降解的概率，一定要确保所有离心管和药匙始终冷却。

如果使用Trizol，可以按照试剂盒推荐的比例把试剂直接加到植物材料中研磨，这样即使是室温研磨RNA也不会发生明显降解。

不管是使用柱纯化试剂盒还是Trizol，想要确保RNA质量高，最关键的一点是保证足够的液料比（裂解液：植物材料质量）。一般来说柱纯化试剂盒每个纯化柱能够处理的最大样品鲜重在100毫克，Trizol法一般也控制在每毫升提取液最多100毫克鲜重（10:1）。

如果过于贪心，想用一个纯化柱推荐的裂解液体积处理200毫克材料，结果一定是令人失望的。即便拟南芥是非常容易提取RNA的材料，5:1的液料比也不会有好结果。如果植物材料富含多糖多酚，还要进一步提高液料比，20:1~40:1都是很常用的比例。

（14） 提取过程中的注意事项

对于柱纯化，务必要确保每一步离心都要充分。有时因为溶液太过黏稠，离心不充分时溶液很难一下子全部通过过滤柱或者RNA吸附柱，因此要根据情况延长离心的时间以及加大离心力。最后一步乙醇洗涤之后，一定要再次离心一到两分钟并开盖晾干几分钟彻底除去乙醇，以免影响下游反应。

对于溶剂提取法，有两个做法可以提高RNA的质量。一是加氯仿之前，就要离心去除不溶的细胞碎片（有些品牌试剂的说明书没有特别强调这一步，反而出于节约时间的考虑建议直接向裂解液中加氯仿萃取然后离心），然后将上清吸出后再加氯仿萃取分层。这样做可以提高色素和蛋白的萃取效率，提高RNA纯度。

二是异丙醇沉淀RNA在室温下进行，总时间10分钟。低温下沉淀反而会使得某些杂质与RNA共沉淀下来，室温沉淀有利于提高纯度。不用担心RNA降解的问题，RNA在异丙醇中非常稳定。

（15）如何应对RNA酶污染

对待RNA酶污染的态度，大抵分为两类，一类是草木皆兵型，即便所有的器材都用高浓度DEPC处理好几遍、采样过程全程液氮低温、磨样品时液氮冷却到手冻伤、提取过程全程戴口罩戴手套一句话也不说，还是战战兢兢担心RNA会降解，仿佛哪怕旁边的人从他身边走过都会带来RNA酶污染。

另一类是满不在乎型，觉得自己什么器材都不处理，不戴口罩不用RNase灭活喷雾，全过程室温，自己每次提出来的RNA用Nanodrop测参数也都很好。这两种极端都不可取。严重的RNA酶污染并不是每次都会出现，甚至可以说非常罕见，可能几个月几年都遇不到一次，但是轻度的RNA酶污染其实很常见，只不过如果只用Nanodrop检测在吸光度上没有明显的迹象，需要通过琼脂糖电泳或者毛细管电泳才能发现（RIN值下降）。

所以，RNA提取实验，对RNA酶最起码的尊重还是要有的，器材一定要用无酶/除酶的，操作环境保持最基本的洁净，DEPC处理一遍就可以了。但是也不至于提RNA时自己一句话也不说，还不准别人从周围走过。如果真的发生严重的系统性污染，RNA一直严重降解，通常要考虑提取试剂、DEPC水是不是被污染，以及移液器是否发生过严重倒吸导致整个内部都被细菌污染。

（16）植物总RNA的特别之处

建议新手或者最近实验环境发生较大变化的时候一定要通过电泳检测RNA的完整性，而不是只依赖于分光光度计。教科书上一般都写完整的RNA电泳时主要有三条带，分别是28S、18S和5.8S三个核糖体RNA，28S rRNA的亮度大约是18S rRNA的两倍。但是植物总RNA特别是光合组织的RNA与动物细胞总RNA相比有明显的区别，通常至少有6条带，且最大条带的沉降系数与人RNA往往不一样，通常为25S（以拟南芥为例）。

其中25S、18S和5.8SrRNA是来自于细胞质基质的80S核糖体，所有标记为绿色的23Sab、16S、5S和4.5S rRNA都来自于叶绿体70S核糖体。16S与18S对应，23S与25S对应，特别的，正常情况下叶绿体中的23S rRNA转录出全长前体后会裂解成两个分子，这也就是为什么在电泳图中看不到25S和18S之间的23S RNA，只能看到两条比16S更小的条带。在某些突变体中可以看到未被剪切的23S rRNA前体。